研究・業績

　我々は1997年に、サイトカインシグナル伝達の主要な経路であるJAK-STATシグナル伝達経路を抑制する分子としてSOCS-1(Suppressor Of Cytokine Signaling)をクローニングした(Naka et al., Nature 1997)。その後、SOCS-1 KOマウスの作製により、SOCS-1がin vivoにおいてもJAK-STATシグナル伝達経路を抑制する分子であり、SOCS-1の欠損によりJAK-STATシグナル伝達が恒常的に活性化されて、多臓器にわたり炎症が惹起され、3週間以内にマウスが死亡することを明らかにした(Naka et al., immunity 2001)。また、ヒトのがんにおけるSOCS-1の発現異常(Komazaki et al. Jpn J Clin Oncol 2004)や遺伝子異常、さらにSOCS-1 HE KOマウスは自己免疫疾患を発症することなども明らかにし(Fujimoto et al. Int Immunol 2004) 、SOCS-1と炎症・がんとの関連を明らかにした。
　JAK-STATシグナル伝達経路（主にSTAT3）の恒常的活性化が癌細胞の生存や増殖に深く関わることから、STAT3の活性化を制御するSOCS-1/SOCS-3に注目し、アデノウイルスベクターを用いたSOCS遺伝子治療法の開発に着手している。これまでに、非増殖型アデノウィルスベクターにSOCS-3遺伝子を組み込み、悪性胸膜中皮腫の担癌モデルマウスに投与し、高い抗腫瘍活性を持つことを確認している（Iwahori et al., Int J Cancer 2011)。今後、難治性癌の１つである胸膜胸膜中皮腫を対象に医師主導型治験をがんセンター東病院で行うべく研究を進めている。将来的には、頭頚部腫瘍、肺癌(Shimada et al., Cancer Sci 2013)、胃癌(Souma et al., Int J Cancer 2012, Natatsuka et al., Br J Cancer 2015)、食道癌(Sugase et al., Int J Cancer 2017, Sugase et al., Cancer Res 2017)、肝臓癌、皮膚癌(Tagami-Nagata et al., Exp Dermatol 2015) などの難治性癌も視野に入れた開発を行う予定である。

　我々は難治性癌に対する創薬標的分子の探索を目的として、定量的プロテオミクス手法を用いて、食道癌に高発現する細胞膜タンパク質の発現解析を行った。その結果、食道癌に有意に高く発現している細胞膜蛋白質としてGlypican-1(GPC1)を同定した(Hara et al., Br J Cancer, 2016)。食道癌手術組織を用いた詳細な解析の結果、GPC1は食道癌組織にて高発現していることやリンパ節など転移先の臓器にも発現が保持されること、GPC1の発現が高い程、予後が悪いことを明らかにした。さらに、難治性癌である膵臓癌においてもGPC1が原発のみならずリンパ節や肝臓など遠隔転移部位にも高発現を示すことと、GPC1の高発現は膵臓癌においても予後不良となることを明らかにした(Nishigaki et al., Br J Cancer, 2020)。興味深いことにGPC1は膵臓癌組織において癌細胞だけでなく、癌関連線維芽細胞(cancer associated fibroblast：CAF)にも高発現を示すが、非癌部位の線維芽細胞では発現しない(論文投稿中)。GPC1は、heparan sulphate proteoglycans (HSPGs)ファミリーの分子の1つであり、FGF-2、HGF、HB-EGFなどのheparin-binding growth factors(HBGFs) の共役受容体として機能することが知られており、癌の増殖や転移を促進することも報告されている。そこで、我々はGPC1が難治性癌に対する治療標的になり得るのではないかと抗体医薬の開発を着手した。
　近年、モノクローナル抗体を利用して抗癌剤を癌細胞に特異的に送達する技術として抗体薬物複合体(Antibody-drug conjugate: ADC)が注目されている。ADCはモノクローナル抗体にリンカーを介して抗癌剤を結合させたものである。正常組織に発現しておらず癌組織に発現を示す抗原に対するモノクローナル抗体をADC化し、癌患者に投与すると癌抗原を発現する癌組織特異的に抗癌剤を輸送することが出来るため、癌細胞への薬効を保持しつつ、正常組織への毒性を軽減させることが可能となる。我々はGPC1がADCの標的として有用であるのではないかと考え、抗GPC1モノクローナル抗体を作成したところ、複数クローン樹立することに成功した。これらのクローンの内、細胞内侵入活性の高い抗GPC1モノクローナル抗体を数種類のクローンを取得することに成功した。そして、細胞内侵入活性を有する抗GPC1抗体に強力な微小管重合阻害剤であるMonomethyl auristatin F (MMAF)をコンジュゲートすることでADC化したGPC1-ADC(MMAF)を独自に開発することに成功した。GPC1-ADC(MMAF)はin vitroでGPC1陰性細胞には細胞増殖阻害を示さず、GPC1陽性細胞に対しては強力な細胞増殖阻害活性を示した(Matsuzaki et al., Int J Cancer, 2017, Nishigaki et al., Br J Cancer, 2020, Yokota et al., MCT, 2021) 。さらに、担癌マウスを用いた薬効解析の結果、GPC1-ADC(MMAF)はGPC1を発現する腫瘍に対して抗癌剤を特異的に輸送し、高い抗腫瘍効果と安全性を発揮すること明らかにした(Matsuzaki et al., Int J Cancer, 2017, Nishigaki et al., Br J Cancer, 2020, Yokota et al., MCT, 2021)。
　膵臓癌は間質が多く、間質のバリアによって癌細胞への抗癌剤の送達が妨害されることが膵臓癌における化学療法に抵抗性を示す原因の1つとして考えられている。そのため、膵臓癌のように間質が豊富な難治性癌においては、間質のバリアを克服するような治療戦略が必要である。そこで、我々は細胞膜透過性を有し、バイスタンダー効果を有するペイロードであるMonomethyl auristatin E (MMAE)をコンジュゲートしたGPC1-ADC(MMAE)を作成した。膵臓癌PDXを用いた解析の結果、GPC1-ADC(MMAE)はGPC1陽性のCAFに取り込まれ、CAF内部でリンカーが切断されて生じたMMAEがCAFから細胞外にMDR1を介して排出され、CAF周囲の膵臓癌細胞に対して抗腫瘍効果を発揮することを確認した(論文投稿中)。これらの結果、GPC1を標的としたADCは間質が豊富な難治性癌である膵臓癌などに対しても画期的な治療薬になり得る可能性が示唆された。これまでに抗GPC1モノクローナル抗体のヒト化、ADC化も完了しており(Munekage et al., Neoplasia, 2021)。現在、GPC1を標的とした難治性癌に対する新たな抗癌抗体医薬品の開発を進行中である。

　卵巣癌は予後不良な悪性疾患であり、臨床・基礎研究の重要度が高い腫瘍である。卵巣癌は無症状で経過することが多く、症状を呈する時点では進行癌となっていることが多い。そのため診断時には70%以上がIII期以上の進行癌であり、進行癌の5年生存率は40%と低い。治療は、手術・化学療法が中心であるが、完全切除が不可能な症例も多い。
　当研究室では卵巣癌細胞における細胞膜タンパク質の網羅的発現解析を行い、高発現を示す分子としてlipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR) を同定し、この高発現が卵巣癌の予後不良因子であることを発見した(Hiramatsu, et al., Cancer Res, 2018)。LSRは正常卵巣組織と比較して卵巣癌組織において高く発現し、LSR高発現患者群は低発現患者群と比較して有意に予後不良であった。LSRは卵巣癌のリンパ節転移や大網転移先の癌細胞にも発現しており、癌の転移や腹膜播種などにも関与している可能性がある。
　LSRは正常細胞においては脂質の細胞内取り込みや細胞接着分子として機能する分子として報告されている。しかしながら癌細胞におけるLSRの機能はまだ完全には明らかにされていない。我々は独自に開発した抗LSRモノクローナル抗体を用いてヒト卵巣癌細胞株移植マウスおよび卵巣癌組織を移植したPDXマウスに対して抗腫瘍効果の検討を行ったところ、抗LSR抗体はADCC活性非依存的な強い抗腫瘍活性を有することをin vivoで明らかにした。この際、抗LSR抗体投与により、癌細胞内の脂肪滴が減少したことから、抗LSR抗体が腫瘍組織内への脂質取り込みを抑制することも確認した。LSR陽性癌細胞はグルコース、FBS欠損培地でVLDLを細胞内に取り込み、細胞の増殖・生存作用を発揮する。そして、抗LSR抗体はLSRによるVLDLの細胞内への取り込みを阻害することで、VLDLを介した癌細胞の増殖・生存作用を阻害することから、LSRを標的とする抗癌剤は脂質代謝を標的とする新たな抗癌剤としての実用化が期待される。当部門では卵巣癌の増殖・生存・腹膜播種におけるLSRの機能解析と並行し、抗LSR抗体による抗腫瘍効果の詳細な作用機序を明らかにし、LSR陽性卵巣癌など難治性癌に対する新規抗体医薬の実用化を目指した研究を行っている。

　我々のグループでは、複数アカデミア（慶應義塾大学、高知大学、医薬基盤・健康・栄養研究所）と複数企業（田辺三菱製薬、小野薬品工業、第一三共製薬）と協力して連携体制を組み、免疫炎症性難病を対象に創薬を目標とするマルチオミクス研究を実施している。各大学の附属病院において、正確な診断と適切な治療を受けている免疫炎症性難病患者さんの貴重な検体を治療前後で収集し、フローサイトメトリーによる免疫細胞のフェノタイピング、免疫細胞のトランスクリプトーム解析、血清のプロテオミクス解析によって詳細かつ網羅的なデータ取得を行い、医薬基盤・健康・栄養研究所において臨床情報とともにデータベースへと順次集積していく。製薬各社およびアカデミアはこのデータベースを活用してシーズ探索を行い、独自の基礎・応用研究に取り組みながら免疫炎症性難病の病態解明や創薬を目指す。このような多施設共同の枠組みは、従来型のアカデミアと企業との一対一の共同研究の弱点克服を目指して、難病患者さんの貴重な検体とそのオミクスデータを参加施設内の共有財産とするものであり、希少難病研究の効率化と活性化をはかるユニークな試みである。

　我々はプロテオミクス解析の手法を応用して、治療前・後の関節リウマチ患者血清に含まれる蛋白質を網羅的に分析し、治療前（活動期）で有意に上昇して治療後に速やかに低下する蛋白質Leucine-rich alpha-2-glycoprotein (LRG)を同定した(Serada et al., Ann Rheum Dis. 2010)。LRGは肝細胞で産生される血清蛋白として知られていたが、我々の一連の解析から、IL-6、TNF-α、IL-22といった炎症性サイトカインによってLRGの発現が誘導され (Serada et al., Inflamm Bowel Dis. 2012)、しかも炎症部位では様々な細胞（上皮細胞やマクロファージ、好中球など）からLRGが産生されていることが明らかになった。現在、炎症マーカーとして使われているC反応性蛋白質(CRP)は、IL-6依存的に肝細胞で産生され、その他の炎症性サイトカインの刺激や他の細胞ではほぼ発現が誘導されない。したがって、LRGはより広範な疾患病態で炎症マーカーとして利用できる可能性がある。事実、IL-6阻害治療中の関節リウマチ患者においては、CRP発現自体が抑制されるためCRPを疾患活動性マーカーとして使うことが出来ないが、LRGは様々な炎症性サイトカインにより炎症局所で産生されるために、IL-6阻害中でも疾患活動性に応じた上昇が認められる (Fujimoto et al., Arthritis Rheumatol. 2015)。また、病勢がCRPに反映されないことがある潰瘍性大腸炎では、血清LRGがCRPよりも疾患活動性と良く相関することが明らかになった（Shinzaki et al., J Crohns Colitis. 2017）。この成果を契機に臨床検査用のLRG測定系開発が着々と進められ、LRGは2020年に潰瘍性大腸炎やクローン病に対する疾患活動性評価マーカーとして保険収載されることになった。これまで、我々のグループでは、乾癬、皮膚筋炎の肺病変、新生児感染症などにおいて、血清LRGが疾患活動性マーカーとして有用性を発揮する事を明らかにしており(Nakajima et al., J Dermatol Sci. 2017, Fujimoto et al., Sci Rep. 2020, Ishida et al., PLoS One. 2020, Kajimoto et al., PLoS One. 2020)、より多くの疾患の診療にLRGを応用することを目指している。
　我々はまた、LRGの機能面についても検討も行なっている。LRGノックアウトマウスを独自に作製して、マウスにさまざまな疾患を誘発させたところ、関節炎が軽減されたり (Urushima et al., Arthritis Res Ther. 2017)、肺線維症が軽減されたり（Honda et al., Physiol Rep. 2017）、乾癬様皮膚炎が軽減されたり（Nakajima et al. J Immunol, 2021）することが明らかになった。このことはLRGが炎症の増悪に何らかの形で関わっていることを示唆している。現在、様々な疾患マウスモデルを用いてLRGの機能面での解析を行い、創薬標的としてのLRGの評価を行っている。

　中枢神経系の症状を呈する自己免疫疾患の診断において、画像、特にMRI画像は血清、髄液とともに病態の総合的判断材料として広く用いられている。しかし、臨床的に中枢神経症状が明らかであっても、通常診療で使われるMRI（1.5テスラ(T), 3T）では異常が検出されないケースがあり、これは小型血管よりもさらに細い血管（微小脳血管）に炎症の主座が存在する可能性がある（Murata et al. Neuroreport, 2015）。本研究では、髄液、血清のサイトカインプロファイルおよび急性期タンパクなどの炎症マーカーを新たに評価するとともに、高磁場MRI（７T）を用いて従来のMRIでは検出できない微小脳血管炎を描出し、炎症マーカーの動きと得られた画像所見との関連を調べる。現状では診断が困難な自己免疫疾患の中枢神経病変について、新たなマーカーや評価指標を開発することを目指す。